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激素对2种曼地亚红豆杉离体胚培养的影响

 

发布日期:[2012/8/31 14:20:56]    点击率:[897]   来源:泰安市泰山区红豆杉繁育推广中心

 

 

   专家考察了几种培养基和激素组合对两种曼地亚红豆杉种胚愈伤诱导的效果,并获得了一个来源于南方红豆杉种胚的细胞株Tm.利用Tm细胞株和继代6年以上的细胞株C42进行了再分化诱导的研究,获得了不同分化程度的绿色愈伤组织和不定芽(原基);证明长期继代的脱分化细胞仍有分化的潜能;证实分化的绿色愈伤组织的紫杉醇含量都较未分化愈伤组织高.正交实验结果的直观分析显示:几种激素对Tm愈伤的转绿率影响大小依次为玉米素(ZT)、6BA、BR和2,4-D,**佳激素组合为0.5mg/L6-BA与6mg/LZT及17000ng/LBR;对Tm愈伤诱导分化出芽的影响大小依次为6-BA、ZT、2,4-D、BR,**佳组合为1.0mg/L6-BA与4mg/LZT及17000ng/LBR;对C42愈伤组织转绿率的影响大小依次为ZT、6-BA、BR、2,4-D,**佳的激素组合为1.0mg/L6-BA与4mg/LZT及1700ng/LBR.
  通过梯度浓度的蔗糖溶液(0~1 mol/L)的筛选,分拣出7种不同物理学密度的红豆杉细胞聚集体,并对它们进行了木质素含量及紫杉醇含量测定.结果显示:不同的细胞聚集体在物理学密度、木质素含量、紫杉醇含量、生长速度等方面存在着差异,其中密度**小的细胞聚集体木质素及紫杉醇含量分别是密度**大的细胞聚集体的5倍和8倍,并且在一定密度范围内(高于0.2 mol/L蔗糖溶液密度),细胞聚集体的木质素含量与紫杉醇的含量呈平行关系,表明不同聚集体紫杉醇含量与细胞分化有一定的关系.
  通过对悬浮培养的细胞聚集体切片的组织学观察和细胞显微形态计量学分析,发现悬浮培养的中国曼地亚红豆杉细胞聚集体分化为为三层不同的区域:中心区域细胞结构基本消失,有些呈“中空”状结构,中层区域由增殖分生能力强的细胞组成,外层区域由成熟的细胞组成.细胞原位TUNEL技术检测证实细胞聚集体内存在着细胞凋亡现象,聚集体外层及中层细胞的凋亡率分别为13%和3%.
  研究了BR对悬浮培养的中国红豆杉细胞生长、紫杉醇合成及苯丙氨酸裂解酶活性的影响.添加1.7 ng/L、17 ng/L和170 ng/L的BR分别使细胞的紫杉醇含量增加了58.7%、103.9%和86.9%.并且低浓度下油菜素内酯有轻微促进细胞生长的作用.在17 ng/L的BR诱导作用下,红豆杉细胞PAL在40小时内达到峰值,并显著高于对照.
  研究了钒酸钠对中国红豆杉悬浮培养细胞的细胞活力、紫杉醇含量及过氧化物酶和苯丙氨酸裂解酶的活性的影响.结果表明,钒酸钠对红豆杉悬浮培养的紫杉醇合成有明显的促进作用,添加50 μmol/L的钒酸钠使细胞的紫杉醇含量增加了71.3%.钒酸钠作用下红豆杉细胞的PAL和POD的活性短时间内都有显著的升高.
  对中国曼地亚红豆杉悬浮细胞超低温保存中几个主要因素对细胞存活率的影响进行了研究.结果表明:选取培养16天的细胞进行超低温保存效果**好;10%DMSO与8%葡萄糖作为混合冰冻保护剂对冷冻细胞起到**佳的保护效果;较好的降温程序是在0℃中预处理30分钟后移入-20℃中停留180分钟,然后转入-70℃中停留30分钟,**后投入-196℃液氮中保存.对保存后细胞的恢复性生长进行了验证.

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